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干貨來啦！AAV感染小鼠腸道及注射劑量指南

山東朱氏藥業(yè)集團有限公司2022/10/12 13:02:13

近期，小編接觸到很多老師咨詢腸道方向的AAV的注射方式，本期我們將對腸道的病毒感染方式及AAV參考劑量進行總結(jié)。







首先，我們了解一下腸道系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，小腸全長約4-6米，分為十二指腸、空腸和回腸三部分；上連胃幽門，下接盲腸隨后連接大腸（包括盲腸含闌尾、升結(jié)腸、結(jié)腸右曲、橫結(jié)腸、結(jié)腸左區(qū)、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸）。

常見感染腸道的注射方式主要分為4種，分別為尾靜脈注射、腹腔注射、灌腸和腸系膜動脈注射[1，2]。其中系統(tǒng)性的遞送途徑包括尾靜脈注射和腹腔注射，這兩種注射方式操作簡單，但不具有特異性，除了腸道其他組織器官也有可能感染，同時病毒的損耗也會比較大：

一、 尾靜脈注射尾靜脈注射是常見的的系統(tǒng)性注射方式，通過這種方式可以感染全身的大多數(shù)器官，它的優(yōu)點是操作簡便，對動物的損傷較小，缺點是無法實現(xiàn)特異性感染，尤其是肝臟、血管等更易感。







具體步驟如下（來源于吉凱平臺）：尾靜脈注射示意圖（圖片來源于吉凱）










1. 實驗前準備

準備內(nèi)容：小鼠、小鼠固定器 ( 或 50ml 離心管）、1ml 注射器、酒精棉球、病毒 ( 冰浴融化）、生理鹽水或 PBS。







2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴，將其放在鼠籠蓋或手臂上，并進行適當安撫；

b. 然后將小鼠裝入固定器 ( 可用 50ml 離心管改造）中，蓋緊蓋子，并使其尾巴朝外露出；

c. 用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使其血管擴張 ( 也可用熱水、加熱器等）。







3. 病毒注射

a. 用生理鹽水或 PBS 將病毒稀釋至合適滴度 ( 控制病毒注射體積在100-200μl）；

b. 用 1ml 注射器吸取 100~200μl 病毒；

c. 將小鼠尾巴拉直使其紅色靜脈清晰可見，在距尾尖 1/3 處進針，緩慢注入病毒后拔出，用棉球按壓注射點 1min 左右以止血。







4. 動物恢復(fù)

將小鼠從固定器上取下，放回原飼養(yǎng)籠中。二、腹腔注射腹腔注射的方式適用于脂肪、肌肉、胰腺、腸道等全身器官，以及新生鼠（造成的損傷較小），通過這種遞送途徑，腸道的平滑肌及漿膜感染概率更大，可以觀測到散在的GFP染色，但是上皮細胞感染的概率較小。







具體步驟如下（來源于吉凱平臺）：腹腔注射示意圖（圖片來源于吉凱）










1. 實驗前準備

準備內(nèi)容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、1ml 注射器。

吸取病毒：用 1ml 注射器吸取適量病毒，置于冰上備用。







2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴，將其放在鼠籠蓋或手臂上，并進行適當安撫；

b. 然后左手握小鼠，用拇指和食指捏住小鼠頸背部，用無名指及小指固定其尾和后肢，確保小鼠軀體舒展且不能亂動。







3. 病毒注射

a. 右手取吸好病毒的注射器，翻轉(zhuǎn)左手使小鼠頭部朝下且腹部完全暴露給操作者；

b. 手持注射器在下腹部離腹白線約 0.5cm 處下針，使針頭與小鼠腹部約成 30°夾角刺入腹部，刺入過程中如感覺到抵抗力突然消失，表明針頭已進入腹腔，此時調(diào)整針頭方向約與小鼠腹部平行，緩緩進針；

c. 針頭進入適當距離后，勻速注射病毒液后，緩緩拔出針頭 ( 旋轉(zhuǎn)針頭以避免漏液）。







4. 動物復(fù)蘇

將小鼠放回原飼養(yǎng)籠中，注意觀察小鼠狀態(tài)。







除了系統(tǒng)性的遞送方式外也可通過局部注射的方式實現(xiàn)AAV的遞送，腸道方向包括灌腸和腸系膜動脈注射的方式，優(yōu)點是病毒劑量更小、可以直接感染需求部位，但同時也具備一定的缺點，那就是對動物造成的損傷更大。三、灌腸有文獻報道通過灌腸的方式感染腸道組織，由于需要通過小鼠肛門插管進行灌腸，因此感染深度具有一定的局限性，感染結(jié)腸的概率更大，一般小鼠劑量推薦4E10vg/只以上，體積200μl。










具體步驟如下（來源于參考文獻[1,3,4]）：







1. 實驗前準備

準備內(nèi)容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、聚乙烯導(dǎo)管。

吸取病毒：用 1ml 注射器吸取適量病毒，置于冰上備用。







2. 病毒注射

a．首先使用異氟醚麻醉小鼠；

b．然后將聚乙烯軟管插入距離離肛門4厘米深的小鼠結(jié)腸部位，使用注射器緩慢注入適量的病毒；

c．注射完畢后，將小鼠在垂直倒立狀態(tài)保持1分鐘以上，以確保病毒在結(jié)腸部位的均勻分布；

d. 待小鼠復(fù)蘇后可以恢復(fù)正常飲水及飲食。四、腸系膜動脈注射腸系膜動脈是分布于消化管的動脈，主要分為腸系膜上動脈和腸系膜下動脈，結(jié)合小腸結(jié)構(gòu)圖來看，腸系膜上動脈分布于小腸左側(cè)，腸系膜下動脈分布于結(jié)腸、大腸及泄殖腔部位，因此通過該方法可以感染小腸及結(jié)腸部位的細胞。







具體方法如下（來源于參考文獻[1,2,5]）：

a.  保定完成后使用異氟醚麻醉小鼠；

b.  通過左上方的皮膚進行1-2 cm的穿刺沿著腋線和側(cè)腹的脾臟區(qū)域。切開腹外斜肌暴露SMA（腸系膜動脈）。使用微型牽開器將皮膚和腹壁固定，并用溫暖的鹽水紗布覆蓋小腸防止回縮；

c.  使用微血管放大器在放大20倍的情況下，將SMA輕輕地從腹膜后剝離，在近端傷口周圍放置連接注射針，使用一個微型血管鉗暫時夾閉血管腹主動脈；

d. 將定制33號1/2‘’英寸點式2型進樣針（Hamilton; Reno, NV)）連接250 μl漢密爾頓TLL氣密性進樣針注射器插入腸系膜動脈，輕輕結(jié)扎血管保持穩(wěn)定防止注射泄漏，隨后進行病毒注射；

e.  注射結(jié)束后取下注射器械，解除夾閉，使血液流回腸道組織。




腸系膜動脈注射示意圖




*后，小編對腸道系統(tǒng)的AAV注射方法及劑量進行總結(jié)，大家可以根據(jù)自己需求進行選擇預(yù)實驗的參考劑量，設(shè)置梯度，選擇*佳劑量：







腸道系統(tǒng)AAV感染范圍及劑量參考注射方法感染部位參考劑量注射體積尾靜脈注射全身大部分器官、血液系統(tǒng)＞2E11vg/只

小鼠100-200μl灌腸結(jié)腸更易感（少量腸上皮細胞感染）4E10vg-1E11vg/只小鼠200μl

大鼠700 μl腹腔注射腹腔腸道平滑肌、漿膜感染

（無上皮細胞感染）＞1E11vg/只50-100μl（不超過10 μl/g）腸系膜動脈注射腸系膜上動脈小腸左側(cè)（可感染上皮細胞）5E10vg-1E11vg/只100-200μl腸系膜下動脈結(jié)腸（更易感）、大腸、泄殖腔（可感染上皮細胞）




【參考文獻】

[1] Polyak S , Mah C , Porvasnik S , et al. Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2 and 5.[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2008, 53(5):1261-1270.

[2] Steven P , Annette M , Stacy P , et al. Identification of adeno-associated viral vectors suitable for intestinal gene delivery and modulation of experimental colitis[J]. American Journal of Physiology Gastrointestinal & Liver Physiology, 2012, 302(3):296-308.

[3] Zheng X , Lv Y , Li S , et al. Adeno‐associated virus‐mediated colonic secretory expression of HMGB1 A box attenuates experimental colitis in mice[J]. Journal of Gene Medicine, 2016.

[4] Zheng X Y , Lv Y F , Li S , et al. Recombinant adeno-associated virus carrying thymosin β4 suppresses experimental colitis in mice[J]. World Journal of Gastroenterology, 2017, 23(2):242.

[5] Porvasnik S L , Mah C , Polyak S . Targeting murine small bowel and colon through selective superior mesenteric artery injection[J]. Microsurgery, 2010, 30(6):487-493.