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造血干細(xì)胞CFU（Colony Forming Unit）集落形成檢測(cè)

山東朱氏藥業(yè)集團(tuán)有限公司2022/10/19 8:39:52

實(shí)驗(yàn)概要

造血干細(xì)胞CFU（Colony Forming Unit）集落形成檢測(cè)




主要試劑

DPBS，HSCs培養(yǎng)液，MethoCult®培養(yǎng)基，HSCs稀釋液




主要設(shè)備

離心機(jī)，超凈臺(tái)，體視鏡，倒置顯微鏡，35 mm、100 mm培養(yǎng)皿，注射器，16號(hào)鈍針頭，移液器，渦旋儀，5 mL、10 mL移液管，離心管




實(shí)驗(yàn)步驟

1)將所需要的MethoCult®培養(yǎng)基在2-8℃過(guò)夜或室溫融化。

(2)用16 號(hào)鈍針頭的注射器將培養(yǎng)基分裝于流式管中（3.3ml/管）

(3)準(zhǔn)備三個(gè)35 mm的培養(yǎng)皿，制備雙份培養(yǎng)系統(tǒng)。具體方法如下：把兩個(gè)35mm的帶蓋培養(yǎng)皿和一個(gè)盛有水的35mm無(wú)蓋培養(yǎng)皿一起放置到100 mm的培養(yǎng)皿中。

(4)準(zhǔn)備CD34 細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后用0.3mlIMDM 2％FBS稀釋細(xì)胞至10倍的接種終濃度。推薦細(xì)胞數(shù)是每個(gè)3.5 cm培養(yǎng)皿500～2000個(gè)細(xì)胞。然后把稀釋后的細(xì)胞懸液按照1：10的比例加到MethoCult®培養(yǎng)基中

(5)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有MethoCult®培養(yǎng)基的流式管后立刻劇烈渦懸振蕩。然后靜置5 min，使氣泡消散。

(6)將無(wú)菌的16號(hào)鈍端針頭接到無(wú)菌的3mL注射器上，用注射器吸取MethoCult®培養(yǎng)基和細(xì)胞的混合物，每個(gè)3.5 cm培養(yǎng)皿中加入1.1mL，蓋好蓋子。每接種一支試管的混合物，用一套新的鈍端針頭和注射器。

(7)重復(fù)（5）-（6）中操作，將細(xì)胞接種到另外一個(gè)35 mm培養(yǎng)皿中。

(8)輕輕傾斜并旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪滿(mǎn)，并分布均勻。

(9)將接種好細(xì)胞的35 mm培養(yǎng)皿置于10 cm培養(yǎng)皿中，并在不蓋蓋子的35 mm培養(yǎng)皿中加入3 mL無(wú)菌水，把10 cm培養(yǎng)皿的蓋子蓋好。

(10)將培養(yǎng)皿置于CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14～16天。

(11)經(jīng)過(guò)14～16天的培養(yǎng)后，進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

在培養(yǎng)的不同時(shí)期取1×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行CFU培養(yǎng)，隨培養(yǎng)天數(shù)增加，CFU形成數(shù)量和種類(lèi)都有所下降。