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AAV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究中的注射方法（二）

山東朱氏藥業(yè)集團(tuán)有限公司2022/10/27 6:49:38

二．靜脈注射AAV9

（一）新生小鼠的顳靜脈注射

1. 調(diào)整光源位置以便照亮顯微鏡區(qū)域，中等強(qiáng)度的光照*佳。

2. 將一個(gè)新生幼鼠直接置于冰上1-3min，進(jìn)行麻醉。

3. 當(dāng)動(dòng)物在冰上麻醉時(shí)，在注射器中注滿(mǎn)AAV病毒。體積不應(yīng)超過(guò)100μL，體積在30到100μL之間不會(huì)影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

4. 在顯微鏡下觀察幼鼠。用不持注射器的手的食指放在幼鼠口鼻處，中指放在耳芽處，以便拉伸幼鼠的皮膚，可見(jiàn)顳淺靜脈。

5. 確定顳淺靜脈�？赏ㄟ^(guò)皮膚看到位于耳芽前部，周?chē)?xì)血管下部，有一條隱約可見(jiàn)的靜脈血管，從背部到腹部，匯入頸靜脈，這就是顳淺靜脈。

6. 注射器針尖斜面插入顳靜脈。可以看到針尖斜面通過(guò)皮膚的以后被血填充。輕壓注射器，并注意幼鼠臉側(cè)面的靜脈變白。

（二）成年小鼠的尾靜脈注射

1. 確保動(dòng)物進(jìn)入約束裝置。

2. 用酒精擦拭尾巴。

3. 把尾巴置于溫水中。

4. 將注射器吸滿(mǎn)AAV病毒懸液。

5. 將注射器插入尾靜脈中。如果沒(méi)有瞄準(zhǔn)，可以靠近尾巴根部再試一次。

6. 注射病毒溶液。體積控制在100-250μL。

7. 將小鼠放回籠內(nèi)。                                




                                           




圖2：動(dòng)物約束裝置




三．AAV從周?chē)窠?jīng)到目標(biāo)神經(jīng)元的逆行運(yùn)輸

1.選取250g左右的大鼠，通過(guò)25 G 1毫升注射器注射甲苯噻嗪（10mg/kg）和***（100mg/kg）。

2.將麻醉后的大鼠置于無(wú)菌布上。在每只眼睛中滴入一滴聚丙烯酸，以防麻醉造成眼睛干燥。

3.刮去肌肉附近的毛發(fā)并用酒精清潔。用刀片在皮膚上切一個(gè)小口，并用鉗保持刀口開(kāi)放，以暴露肌肉。

4.使用超微量注射器吸入AAV病毒懸液，并排除空氣和氣泡。

5.擠壓肌肉以使肌肉建立起一定的厚度，并把針尖置于肌肉上。

6.緩緩插入針尖，并在肌肉中靜置1min。然后以10μl/min的速度注入10-20μl的AAV懸液。

7.注射結(jié)束后，將針在肌肉中靜置2min，然后緩緩拔出�？蛇M(jìn)行多次注射。

8.縫合皮膚并做耳標(biāo)。將大鼠單獨(dú)放在一個(gè)干凈的籠子里，直到醒來(lái)

9.先用0.1 M NaOH or 10％氯漂白劑清洗手術(shù)工具，并用蒸餾水沖洗，*后用酒精沖洗。







                     

圖3：超微量注射器