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長期培養(yǎng)檢測法檢測造血干細胞（LTC-IC）

山東朱氏藥業(yè)集團有限公司2022/11/1 21:36:29

實驗概要

長期培養(yǎng)檢測法檢測造血干細胞（LTC-IC）




主要試劑

DPBS，HSCs培養(yǎng)液，MethoCult®培養(yǎng)基，HSCs稀釋液、細胞基礎培養(yǎng)液、HLTM液體




主要設備

離心機，超凈臺，體視鏡，倒置顯微鏡鏡，96孔培養(yǎng)板、100 mm培養(yǎng)皿，3mL注射器，16號鈍針頭，移液器，渦旋儀，5 mL、10mL移液管，離心管




實驗材料

M2-10B4成纖維細胞系（ATCC，CRL1942）




實驗步驟

（1）制備飼養(yǎng)層細胞

（2.）HLTM液體分裝

（3）接種被檢測細胞

（4）細胞接種5～6周之后進行檢測，每周半量換液。

（5）收集細胞進行檢測。棄上清，加0.25％Tripsin進行消化，要求消化過程中在鏡下觀察，根據(jù)造血細胞和飼養(yǎng)層細胞消化時間不一樣的原理，待飼養(yǎng)層還沒有消化下來，造血細胞已經(jīng)消化合適時用胰蛋白酶消化終止液終止消化。

（6）下面步驟同CFU檢測方法（3）-（11）。

(3)準備三個35 mm的培養(yǎng)皿，制備雙份培養(yǎng)系統(tǒng)。具體方法如下：把兩個35mm的帶蓋培養(yǎng)皿和一個盛有水的35mm無蓋培養(yǎng)皿一起放置到100 mm的培養(yǎng)皿中。

(4)準備CD34 細胞，細胞計數(shù)儀計數(shù)后用0.3mlIMDM 2％FBS稀釋細胞至10倍的接種終濃度。推薦細胞數(shù)是每個3.5 cm培養(yǎng)皿500～2000個細胞。然后把稀釋后的細胞懸液按照1：10的比例加到MethoCult®培養(yǎng)基中

(5)將細胞轉移到裝有MethoCult®培養(yǎng)基的流式管后立刻劇烈渦懸振蕩。然后靜置5 min，使氣泡消散。

(6)將無菌的16號鈍端針頭接到無菌的3mL注射器上，用注射器吸取MethoCult®培養(yǎng)基和細胞的混合物，每個3.5 cm培養(yǎng)皿中加入1.1mL，蓋好蓋子。每接種一支試管的混合物，用一套新的鈍端針頭和注射器。

(7)重復（5）-（6）中操作，將細胞接種到另外一個35 mm培養(yǎng)皿中。

(8)輕輕傾斜并旋轉培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪滿，并分布均勻。

(9)將接種好細胞的35 mm培養(yǎng)皿置于10 cm培養(yǎng)皿中，并在不蓋蓋子的35 mm培養(yǎng)皿中加入3 mL無菌水，把10 cm培養(yǎng)皿的蓋子蓋好。

(10)將培養(yǎng)皿置于CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14～16天。

(11)經(jīng)過14～16天的培養(yǎng)后，進行克隆計數(shù)。

在培養(yǎng)的不同時期取1×105個細胞進行CFU培養(yǎng)，隨培養(yǎng)天數(shù)增加，CFU形成數(shù)量和種類都有所下降。