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免疫球蛋白IgG的提取-3

山東朱氏藥業(yè)集團(tuán)有限公司2022/11/4 22:17:54

五、蛋白質(zhì)的鹽析法

向蛋白質(zhì)溶液中加入不同濃度的中性鹽，可以把不同的蛋白質(zhì)分別沉淀出來。這種方法稱為蛋白質(zhì)的鹽析。

利用蛋白質(zhì)的鹽析法，可以得到我們所需的不同的免疫球蛋白。*常用的中性鹽包括，硅酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉等，其中以硫酸銨*為常用：

（一）、優(yōu)點(diǎn)

1、在水中溶解度大，其飽和溶液含有大量鹽；

2、在水中的溶解度受溫度的影響很�。�

3、一般不會引起蛋白變性。

（二）、缺點(diǎn)

提取的純度較差，所以只能用它作為粗提。

飽和硫酸銨溶液配法：

取760g～800g硫酸銨，放人70～80℃蒸餾水1000mL中，攪拌約20min，室溫靜置過液，硫酸銨結(jié)晶析出，即上清為飽和硫酸銨，再用NH40H調(diào)pH為7.0。

六、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（一）稀釋血清

向血清中加入生理鹽水，做1︰1稀釋，主要目的，以防蛋白質(zhì)溶液濃度過稠，引起其它蛋白質(zhì)共沉，或局部蛋白質(zhì)變性。

（二）用50％飽和度硫酸銨提取免疫球蛋白

將用生理鹽水按l︰1稀釋的動物血清置于三角燒瓶或燒杯中，在電磁攪拌器不斷攪拌下，逐滴加入與稀釋的蛋白液等量的飽和硫酸銨（血清1體積+生理水1體積+飽和硫酸銨2體積），攪拌的目的是為了防止局部硫酸銨濃度過高。攪拌后，室溫放置0.5～1h，或置4℃冰箱過夜，次日取出，以每分鐘4000轉(zhuǎn)離心30min（離心管周圍加冰塊或冰水），離心后棄上清（內(nèi)含白蛋白等），沉淀物中即含γ和β球蛋白。

硫酸銨溶液的飽和度是指在整個溶液中所占的**比，與原蛋白液的濃度無關(guān)。

分子量大的蛋白質(zhì)先沉淀，分子量小的蛋白質(zhì)后沉淀，球蛋白的分子量20～30萬，而白蛋白的分子量只有69000，所以50％飽和度硫酸銨沉淀的是球蛋白，而白蛋白則留在上清液中。

（三）用33％飽和度硫酸銨提取血清中的γ球蛋白

當(dāng)血清中飽和硫酸銨為50％飽和度時，沉淀三次，仍含有大量的α、β球蛋白及極少量的白蛋白，當(dāng)硫酸銨飽和度由50％減少到33～35％時，沉淀蛋白質(zhì)中的α、β球蛋白和白蛋白的含量相應(yīng)逐漸減少，而γ球蛋白的純度逐漸提高，第三次沉淀物只含有少量的α、β球蛋白及白蛋白。

用生理鹽水或 PBS將沉淀物攪拌溶解，其溶成原血清體積（1體積），向其中滴加飽和硫酸銨1/2體積。使硫酸銨飽和度為33％，邊滴邊攪拌，冰相中靜置O.5～1h，同上法離心，棄上清（a、β球蛋白），按上述步驟再重復(fù)二次，即33％飽和度硫酸銨反復(fù)提取三次，即可獲得

表1 從不同種動物血清中提取y球蛋白所用硫酸銨濃度和沉淀次數(shù)

血清來源硫酸銨飽和度％和沉淀系數(shù)血清來源硫酸銨飽和度％和沉淀次數(shù)家兔

綿羊

馬

山羊

牛35×3

35×3

30×3

30×1 45×1

35×3豬

雞

豚鼠

小白鼠

大白鼠35×3

35×3

35×1 40×2

35×1 40×2

35×3

較純的γ球蛋白。一般來說，蛋白質(zhì)溶液中的飽和硫酸銨濃度達(dá)到即33％時，γ-球蛋白被沉淀出來。但從不同動物的血清中分離γ球蛋白的*適飽和硫酸銨濃度和沉淀次數(shù)不完全相同。從**動物血清中制備γ球蛋白所需的硫酸銨濃度和次數(shù)如下表。

（四）脫 鹽

免疫血清經(jīng)硫酸銨提取后，其蛋白液中含有大量硫酸銨，必須除去，常用的方法有透析法和葡聚糖凝膠過濾法兩種。

1、透析袋除鹽法：半透膜具有使小分子或離子透過而蛋白質(zhì)分子不能通過的特性。一般先用蒸餾水沖洗透析袋（也可用玻璃紙），用橡皮筋或細(xì)繩結(jié)扎透析袋的一端，檢查無破口后，加入擬脫鹽的蛋白液（33％飽和度的硫酸銨沉淀后的蛋白，用原血清量10～20％的生理鹽水溶解），裝完蛋白液，排出空氣，留一定空隙。扎好另一端。開始先用蒸餾水透析過夜，水量至少是蛋白液的50 倍，然后移至PBS或生理鹽水中，置4℃透析2～3d，每天換液二次以上，用氯化鋇溶液檢查SO42+，用奈氏（Nessler′s）試劑檢查NH+。

2、 SepadexG25過柱除鹽法：SepnadexGl0、15、25或50系細(xì)孔凝膠，可排阻**蛋白質(zhì)，而鹽類可自由進(jìn)入，用此法可方便地將蛋白質(zhì)和鹽分成兩個組分，常用G25或G50除鹽，使用的層析柱一般是2.5×25～50cm。凝膠的預(yù)處理、裝柱、平衡等與一般方法相同。

七、實(shí)驗(yàn)步驟

八、注意事項(xiàng)

1、操作過程可以在室溫下進(jìn)行，但溫度不宜太高，應(yīng)盡量在較低溫度下進(jìn)行，避免蛋白質(zhì)活性喪失；

2、鹽析前，血清要用等量的PBS（0.01mol/L pH7.2）或生理鹽水稀釋，可以減少其他蛋白質(zhì)與γ-球蛋白的共沉現(xiàn)象。蛋白質(zhì)含量低于3％時可不稀釋；

3、混有鐵離子的硫酸銨須除去鐵離子。方法是用15N NH40H凋pH至9，加熱，產(chǎn)生棕紅色沉淀，用濾紙濾除，再加稀硫酸（硫酸:水=1:2），調(diào)pH7.0～7.2穩(wěn)定24h后再用；

4、飽和硫酸銨應(yīng)逐滴加入，邊加邊攪，以減少局部高濃度硫酸銨所引起的共沉現(xiàn)象，攪拌速度不宜過快，以免產(chǎn)生泡沫；

5、蛋白質(zhì)被沉淀后應(yīng)在冰箱放置過夜，使能結(jié)成較大的沉淀塊而易于分離。分離（離心沉淀或過濾）沉淀物應(yīng)在4℃條件下進(jìn)行，以免蛋白質(zhì)變性；

6、以上程序（50％飽和度1 次，33％2～3次）可獲得較純的γ球蛋白，有時尚有混少量的β球蛋白；

7、如提純材料為血漿，則先應(yīng)除去纖維蛋白質(zhì)，方法是：先加入2.0％飽和度的硫酸銨，沉淀纖維蛋白質(zhì)，離心沉淀除去之，然后繼續(xù)加硫酸銨至50％飽和度，以沉淀球蛋白。

九、結(jié)果判斷與討論

抗原免疫動物后獲得的抗血清，效價可用上述相應(yīng)試驗(yàn)判斷；其特異性則可通過雙擴(kuò)、免疫電泳或交叉凝集試驗(yàn)進(jìn)行考察。此外，抗血清的外觀應(yīng)該為澄清、力求無溶血、無血液有型成分殘留和無細(xì)菌等微生物污染。

附：實(shí)驗(yàn)動物的抓取、固定和注射方法

在生物制品學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常常用到實(shí)驗(yàn)動物。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，首先要限制動物的活動，使動物保持安靜狀態(tài)，才便于抓取和固定。固定動物的方法依實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和動物種類而定。在抓取、固定動物前，應(yīng)對實(shí)驗(yàn)動物的習(xí)性有所了解。在抓取過程中，既要膽大心細(xì)，又要準(zhǔn)確敏捷，不能粗暴，確實(shí)達(dá)到抓住和固定的目的。在生物制品學(xué)實(shí)驗(yàn)中，為了制備抗體或觀察藥物對機(jī)體免疫功能的影響，需要將抗原或藥物注入動物體內(nèi)。注射的途徑和方法多種多樣，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，�?shí)驗(yàn)動物種類和藥物劑型，抗原的性質(zhì)來確定。

1、皮下注射法（subcutaneous injection，sc，以豚鼠為例）

1）助手用左手夾持動物肩部，并用大拇指鉤住下頜部，將動物提起，右手在下方將動物托起，手心向上，用食指、中指及無名指夾住后腿；

2）用碘酒和酒精棉球消毒豚鼠蹊部。注射者將皮膚提起，以預(yù)先準(zhǔn)備好的注射器針頭（內(nèi)裝無菌生理鹽水）刺入皺褶底部，注射0.5mL。注入時阻力不大而放下皮膚后，皮下呈擴(kuò)散狀隆起者為注射正確。

2、皮內(nèi)注射法（mtracutaneous injection，ic，以豚鼠為例）

1）助手按上法將豚鼠抓緊；

2）實(shí)驗(yàn)者在其腹部任選約2cm2的面積剪毛，消毒皮膚；

3）將5號針頭連接在1mL的注射器上，吸取無菌生鹽水，針空向上平刺人皮內(nèi)，注入 0.1~0.2mL，如準(zhǔn)確注射在皮內(nèi)，則注射部位形成堅(jiān)實(shí)的水泡。

3、腹腔注射（intraperitoneal injection，ip，以小自鼠和家兔為例）

小白鼠：

1）用右手拖鼠尾，使其爬行于較粗糙之臺面上，再突然用左手拇、食指抓緊小白鼠頸項(xiàng)及其兩耳，翻轉(zhuǎn)后，用左手無名指及小指夾住鼠尾及后肢；

2）消毒腹壁，以預(yù)先準(zhǔn)備的材料（無菌生理鹽水）注入腹腔0.3mL。

注意：注射時應(yīng)將小白鼠的頭部向下，以避免針頭刺人內(nèi)臟。針斜刺入皮膚后，轉(zhuǎn)直，再向下直刺少許即可進(jìn)入腹腔，其目的是使兩個針眼不在一條直線上，可避免拔出針頭時注射材料流出污染皮膚及造成注射劑量不足，在注射傳染材料時，應(yīng)特別注意。另外，進(jìn)針部位不宜太近上腹部或進(jìn)針過深，以免刺破內(nèi)臟。

家兔：

1）將家兔四肢固定在解剖臺上腹部朝上；

2）在下腹部略靠外側(cè)（腹部下約1/3處，避開肝和膀胱），消毒該處皮膚，將針頭垂直刺入腹腔，將針筒略為回抽，如無血液或尿液，即可進(jìn)行注射。注入1mL無菌生理鹽水。

4、肌肉注射（intramuscuLar injection，im，以小白鼠為例）

此法用得較少，常用于給動物注射混懸于油或其他溶劑的藥物時。肌肉注射部位，應(yīng)選擇豐滿且無大血管通過的肌肉，一般采用臀部．亦常取大腿內(nèi)（外）側(cè)，頸椎或腰椎旁的肌肉進(jìn)行注射。注射時，將注射部位的被毛剪去（小動物可不剪毛）。注射器連61/2號針頭，由皮膚表面垂直刺人肌肉，略回抽如無回血，即可注射。給小白鼠作肌肉注射時，用左手抓住鼠兩耳及頭部皮膚，右手取連有51/2號針頭的注射器，將針頭刺入大腿外側(cè)肌肉，注入0.2mL無菌生理鹽水。

5、靜脈注射（intravenousinjection，iv，以家兔和小白鼠為例）

家兔：

1）捉兔時，輕開籠門，勿讓兔受驚。將手伸入籠內(nèi)，于兔頭前面阻攔其跑動，當(dāng)兔匍匐不動時，右手抓住頸部皮膚將兔提起，左手隨之托住其臀部，不正確的抓取方法：①易傷兩腎。②易造成皮下出血。③可傷兩耳。正確的抓取方法：抓住頸后皮膚，并用手托起。

2）將家兔固定于特制木箱中或由助手按在桌上（一手輕輕按其頸部，一手輕扶耳根，使耳向前）。剪去或拔去兔耳緣部被毛；

3）用棉球或少許紗布沾取45～50℃的溫水于耳翼邊緣的血管上，或用手指輕彈并輕揉兔耳，使靜脈充血，助手以一手將耳根固定；

4）注射者以左手持該耳，右手將預(yù)先準(zhǔn)備的材料（無菌生理鹽水）出血管注入，針頭刺入時與靜脈幾乎相平行，注入0.5mL。如注射正確，則針下阻力較小，亦可見血管變色；如阻力較大或皮下隆起即停止注射，重新刺入血管，或另選部位；注入液體時應(yīng)將針頭與耳同時固定，以免針頭退出血管；

5）注射完畢用消毒干棉球壓住注射部位，然后拔出針頭，再壓片刻以防出血。

小白鼠：

1）將小白鼠置小試管簍中，鼠尾自網(wǎng)眼中露出；

2）將鼠尾浸于盛45~50℃溫水的試管中1～2min或用棉花沾溫水揉擦尾部使尾靜脈充血，可見三根暗紅色的尾靜脈;

3）選*明顯的一條尾靜脈，用左手三指捏住鼠尾，在距尾尖 2～3cm（此處皮薄脈淺，易刺入）進(jìn)針，針頭與尾靜脈幾乎相平行，注入無菌生理鹽水0.3mL。其余操作同兔耳靜脈注射。

6、胃內(nèi)注入法（灌胃法，ingestion，ig，以小白鼠為例）

1）用左于拇指及食指抓住小鼠兩耳及頭部皮膚，另三指抓其背部皮膚，翻轉(zhuǎn)，使其腹部朝上，頭部向上保持一定的傾斜度;

2）右手持連有灌胃針頭的注射器，將針頭對準(zhǔn)正中線插人口腔，沿咽后壁中線慢慢向后，向下插入。亦可沿鼠右側(cè)嘴角插入，經(jīng)食道進(jìn)入胃內(nèi)。若遇阻力則后退稍許再慢慢進(jìn)針，插入2～2.5cm即可到達(dá)食道下端，注入0.5mL無菌生理鹽水。注入時如通暢，表明針頭已插入食道；如不通暢，動物有嘔吐動作并掙扎，則表明針頭未插入食道，應(yīng)立即拔出，按上法重新操作。

灌胃法的要點(diǎn)在于：小鼠要固定好，頭和頸部保持極平，進(jìn)針方向正確，—定要沿正中線或右口角進(jìn)針，再順著食道慢慢插入，不可硬往里插，否則注入肺內(nèi)，造成死亡。

注射器的準(zhǔn)備與消毒

1、選擇大小適宜而注射針筒與筒芯號碼一致的注射器，并先吸入清水，試其是否漏水，漏水的注射器不能使用，因其注射量不準(zhǔn)確，且易引起污染及傳染；

2、視選擇的動物及注射途徑之不同而選用不同長短大小的針頭，并先試驗(yàn)是否通氣或漏水；

3、消毒時將筒芯從筒中拔出，用脫脂紗布以相同的方向先包針筒后包筒芯，置煮沸消毒器中，選好針頭，包好紗布置煮沸消毒器另一端，同時放入鑷子一把，加入自來水，以覆蓋注射器為度，煮沸10min（從水沸之時算起）；

4、消毒完畢后，用鑷子取出注射器，置筒芯于針筒中，針頭牢固地裝在針筒的針嘴上，使其斜面與針筒上的刻度方向一致，吸入注射材料，準(zhǔn)備注射；

5、若使用一次性注射器，則不必消毒，買來即可使用。

注意事項(xiàng)

1、吸入注射材料后，應(yīng)將注射器內(nèi)的空氣排盡，若注射材料具有傳染性，則排氣時應(yīng)以酒精棉球包住針頭，以免傳染材料流出；

2、注射完畢后，如注射材料具有傳染性，應(yīng)以消毒器中的水抽吸幾次，然后取下針頭，抽出筒芯放入消毒器中與抽吸洗過的水一并煮沸消毒，煮畢后洗凈注射器及針頭置干燥箱中烘干后，分別收藏備用。